Técnicas de Edición de Ácidos Nucleicos en Hipotiroidismo 

Resistencia a la hormona tiroidea debido a THRA mutaciones (RHT a) entidad poco frecuente de causa genética que puede asociar síntomas de hipotiroidismo. Las mutaciones alteran la función de TR a 1, uno de los dos receptores nucleares de la hormona tiroidea.

• Tipo de edición: Ex vivo (in vitro) - Germinal
• Dirigido hacia: ADN
• Dirigido por:  CRISPR/Cas9
• Vectores: se insertó un fragmento de ADN de 20 mer (longitud de cebador) en los sitios de restricción de pX330 con el plásmido Addgene 
• Órgano a tratar: Tejido oseo, tejido nervioso, Tejido muscular (musculo cardiaco) y epitelio intestinal
• Vía de administración: No especifica. (microinyección en ovocitos)
• Resultados: 
• Cabe destacar que este estudio tuvo el objetivo de modelar casos humanos esporádicos de una enfermedad genética en ratones para abordar la relación causal entre una mutación y un fenotipo único,  a consecuencia fenotípica de la TR a 1 N359Y mutación sin sentido presente en un solo paciente
•  Las mutaciones generadas por CRISPR / Cas9 del gen Thra (Receptor alfa de Hormona tiroidea) provocó alteraciones fenotípicas similares a las reportadas en pacientes humanos: deterioro del crecimiento esquelético, alteraciones leves del neurodesarrollo, tendencia a la anemia y reducción del cociente T4 / T3. 

Bibliografía: 

1. Markkossian S, Guyot R, Teixeira M, Aguilera N. La edición CRISPR/Cas 9del gen Thra del ratón produce modelos con resistencia variable a la hormona tiroidea [Internet]. Thyroid. 2018 [cited 2021 Feb 28]. Available from: https://uceedu-my.sharepoint.com/:b:/g/personal/amnaranjol_uce_edu_ec/EfYaITJnD5hGuQSxBYIz55YBgwDPMrfCmSwtwZExtAFndg?e=iJ0dT0

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Terapia con Stem Cells en Hipotiroidismo 

Las células madre del limbo de tipo fibroblasto humano (f-LSC) han adquirido un gran interés como una herramienta potencial para lograr la inmunotolerancia debido a su  “privilegio inmune natural”  y propiedades inmunorreguladoras, en este caso se lo a utilizado en la tiroiditis de Hashimoto (TH) ya que es una enfermedad autoinmune tiroidea en donde existe infiltración de células T citotóxicas, la presencia de autoanticuerpos y la inducción de Fas por citocinas que. destruyen el parénquima tiroideo y por lo cual es causa de hipotiroidismo. 

Tipo de Stem Cell: Stem cell mesenquimales: células madre del limbo de tipo fibroblasto humano

Método de obtención: 

• Aislamiento de células madre limbares comenzó con una disección en la conjuntiva del ojo, detrás del limbo con una cuchilla estéril.
• Posteriormente se incubaron con colagenasa I. Durante la noche a 37 ° C en un baño con agitación y al día siguiente se colocaron en placas de cultivo p60  con el medio de mantenimiento de fibroblastos se le añadió insulina, transferrina y selenio hasta que las células alcanzaron los subcultivos de (f-LSC) se mantuvieron en el medio de expansión

Vía de administración: Se encuentra en ensayos y para determinar los resultados se lo realizo por  cultivos con muestras de sangre de pacientes sanos y con tiroiditis autoinmune.

Resultados: 

• A corto plazo, en 7 días se empezó a detectar efectos inmunosupresores en donde fue capaz de prevenir la activación inapropiada de linfocitos T autorreactivos  mediados por las f-LSC en pacientes con TH además se investigó la producción de citocinas proinflamatorias o inmunosupresoras y la expresión de los factores de transcripción ROR-γT.  Los resultados mostraron que, en células T activadas de pacientes con TH, la producción intracelular de IFN-γ, IL-17A y ROR-γT se redujo considerablemente.

Bibliografía: 

1.Coppola A, Tomasello L, Pitrone M. Human limbal fibroblast-like stem cells induce immune-tolerance in autoreactive T lymphocytes from female patients with Hashimoto’s thyroiditis. Stem Cell Research & Therapy [Internet]. 2017 Jul 3 [cited 2021 Feb 21];8(1). Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5496215/

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Animal transgénico para el estudio de hipotiroidismo congénito 

El simportador Na/I (NIS) media el transporte de yoduro al interior de la célula tiroidea, el primer paso en la biosíntesis de la hormona tiroidea (HT), mutaciones en el gen SLC5A5  (NIS) resulta en una proteína no funcional causante de hipotiroidismo congénito, por un defecto en el transporte de I. En modelos de ratones NIS KO se identificó que una dieta con altas concentraciones de I rescató parcialmente la biosíntesis de HT, y esto indica que existen otra vías distintas al NIS. (1)

• Tema del articulo: Un suministro de yoduro en la dieta extremadamente alto previene el hipotiroidismo severo en ratones knockout para el simportador de Na / I  (gen SLC26A4)
• Tipo de animal transgénico: ratones NIS KO
• Método por el cual fue obtenido: 
• Se obtuvo células madre embrionarias del repositorio del proyecto de ratón knockout, la selección de genes se utilizó para modificar el gen Slc5a5 (NIS). Por recombinación homóloga, se insertó un casete con una señal poliA después del exón 5, mientras que los exones 6 y 7 estaban flanqueados por sitios loxP  y se obtuvo un alelo Slc5a5 TM1a. Este se inyectó en blastocistos para generar ratones quiméricos, que transmitieron el alelo Slc5a5 TM1a a su descendencia.
• Usos que se le a dado: Para probar la hipótesis de que las altas concentraciones de I en el plasma, que resultan de alto que la dieta, hacen posible que I  pueda entrar en las células foliculares tiroideas en ausencia de NIS. (1)

Ventajas y desventajas de los transgénicos 

Ventajas

1. Son muy útiles en la creación de nuevos tipos de medicamentos para algunas enfermedades.
2. La crianza y comercialización de animales transgénicos destaca ya que se trata de una carne con más nutrientes y producen un tipo de carne más sólida.
3.  Mejoran la investigación básica, ya que facilitan un mayor entendimiento de los mecanismos de funcionamiento y control de los genes.
4. Permiten modificar  características de productos alimenticios, como la leche, haciéndolos más adecuados para el consumo humano o más fácilmente transformables por la industria.
5. Ventajas del uso de plantas transgénicas esta la disminución de las pérdidas de cultivo por plagas, y una disminución en el uso de plaguicidas. Mediante la Introducción de genes de  que producen la toxina cry, formando proteínas tóxicas Bt, que las hacen resistentes a las principales plagas.(2)

Desventajas

1. Al modificar especies ya existentes podemos poner en riesgo especies autóctonas.
2. Las reacciones alérgicas o hipersensibles en algunas personas que se podrían desencadenar como consecuencia de la presencia de genes de otras especies en las proteínas consumidas por los seres humanos al alimentarse
3. El efecto tóxico de los cristales de estas proteínas Cry pueden afectar a otros grupos de insectos no relacionados con las plantas de cultivo. 
4. A largo plazo el uso extensivo de agroquímicos que se da a estos cultivos puede ocasionar el surgimiento de súper plagas.
5. La inserción de material genético extraño a un genoma equilibrado y seleccionado durante millones de años tiene como consecuencia la posible inestabilidad estructural y bioquímica del genoma de la planta. (3)

Bibliografía: 

1. Ferrandino G, Kaspari RR, Reyna Neyra A. An extremely high dietary iodide supply forestalls severe hypothyroidism in Na+/I− symporter (NIS) knockout mice. Scientific Reports [Internet]. 2017 Jul 13 [cited 2021 Feb 14];7(1). Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5509730/#CR62

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2. Frank. Animales transgénicos características ventajas y desventajas - Docuciencia [Internet]. Docuciencia. 2020 [cited 2021 Feb 14]. Available from: https://www.docuciencia.es/animales-transgenicos-caracteristicas-ventajas-y-desventajas/

‌3. Mehrgut M. Ventajas y desventajas, Plantas Transgénicas [Internet]. Medium. Medium; 2016 [cited 2021 Feb 14]. Available from: https://medium.com/@miguelmehrgutpalenzuela/ventajas-y-desventajas-plantas-transg%C3%A9nicas-48ffb1711fca

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ADN recombinante artificial en hipotiroidismo congénito (HC) 

Mutaciones en PAX 8 las cuales se asocian con disgenesia tiroidea causante de (HC) mediante la secuenciación  de las regiones codificantes en ADN genómico, para esto se utilizó  ensayos de transfección celular que utilizan varias construcciones de vectores y mutagénesis inducida, además de movilidad electroforética para investigar los efectos de mutaciones seleccionadas (D94N y G41V) en las actividades de transcripción y unión de PAX8 en los promotores de genes diana para TG y TPO. (1)

• T: Identificación y caracterización de nuevas mutaciones de PAX8 en hipotiroidismo congénito
• O: Identificar y caracterizar las mutaciones de PAX8 en clones recombinantes
• G: PAX 8;  La secuencia codificante completa se amplifico por RT-PCR
• ER:  KpnI y XbaI
• EL: No especifica 
• V:  pCDNA3.1(plásmido);
• C R: Células eucariotas - células HeLa
• M T G: Transfección por lipofección 
• M I C:  
• Métodos moleculares:
• PCR, secuenciación 
• Métodos microbiológicos:
• Cultivo de células en DMEN suplementado con penicilina-estreptomicina 
• Metidos bioquímicos:
• Movilidad electroforética (EMSA) 

Recombinación de ácidos nucleicos en la naturaleza 

Un ejemplo de recombinación de AN en la naturaleza sucede en las organismos unicelulares procariontes (bacterias), que consiste en la integración del ADN del donante en el cromosoma receptor mediante recombinación esto se da entre células bacterianas y mediante de tres mecanismos:

• Conjugación:  Proceso de transferencia génica desde una célula donadora a otra receptora, que se realiza por medio de los plásmidos, que es un tipo de ADN circular extracromosomal autoreplicante y se requiere de contacto directo entre genes.
• Transformación: en la que una bacteria incorpora segmentos de ADN de bacterias lisada
• Transducción: Involucra  la transferencia de segmentos de DNA de una bacteria a otra, pero mediada por virus bacterianos (bacteriófagos).(2)

Bibliografia: 

1. Liu S, Wang X, Zou H, Ge Y, Wang F, Wang Y, et al. Identification and characterization of novel PAX8 mutations in Congenital Hypothyroidism(CH) in a Chinese population. Oncotarget [Internet]. 2017 Jan 2 [cited 2021 Feb 8];8(5):8707–16. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5352434/

2. Espinola F. Tras la pista de los replicadores: la transferencia de genes en la naturaleza [Internet]. CICY. 2018 [citado 7 febrero 2021]. Disponible en: https://uceedu-my.sharepoint.com/:b:/g/personal/amnaranjol_uce_edu_ec/EWBDJI1qDsZLgW8pyQHRk9MBBKNXQJ25hMAW5lcMcUtUbQ?e=MKS4fQ

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